Флоровській монастир існував ще до спустошення Києва Менглі-гирєєм (1482 р.). Перше документальне свідоцтво про монастир – грамота від 1566 р. польського короля Сигизмунда ІІ Серпня київському воєводі князеві Костянтину Костянтиновичеві Острожському.
У ній мовиться про закріплення за протопопом Яковом Гулькевічем і його нащадками-священиками має рацію утримувати здавна існуючий монастир при церкві свв. Флора і Лавра і лагодити там службу по грецькому звичаю і закону, тобто здійснювати православні богослужіння.
В 1632 р., при свт. Петрові (Могилі), Митрополитові Київському, внук о. Якова, Іоанн Богуш-гулькевіч, що став ченцем Лаври, відмовився від своїх спадкових прав на Флоровськую обитель на користь ігуменії Агафії (Гуменіцкой) і по ній наступаючей ігуменії… і законніц’ теперешніх’ і напотом’ будучих’. Неодмінна умова: монастир повинен належати Православній Церкві.
В 1711 р. по волі Імператора Петра I до Флоровському був приєднаний Вознесенській жіночий монастир (заснований на початку XVII в.), що знаходився навпроти Св. брам Лаври (нині на цьому місці – колишній арсенал Києво-печерської фортеці).
Флоровськіє сестри успадкували і угіддя Вознесенського монастиря, яких той особливо багато отримав при ігуменій Марії Магдалині Мазепіной – матері гетьмана України Івана Мазепи.
Головний, Вознесенській, собор був освячений в 1732 р. Решта храмів (Казанський, трапезний Тіхвінській і кладовищенський Свято-троицкий), келійних корпусів і ін. будівлі влаштована в XIX в. (після спустошливої пожежі 1811 р.). До 1920-х років в монастирі знаходилася чудотворна Руденськая ікона Божієй Матері (праздн. 13 / 26 липня).
В XVIII-XIX вв. у Флоровськой обителі жили видатні в російській історії подвижники благочестя. З 1758 р. тут до самої кончини трудилися, прийнявши постриження з ім’ям Нектарії, княгиня Наталія Долгорукова (1714-1771 гг.; похоронена в Києво-печерській Лаврі), дочка сподвижника Петра I Би. Шереметева. Коли що сватався до неї і коханий нею князь И.А.
Долгорукий опинився в біроновськой опалі, вона не відмовилася стати його дружиною і відправилася з чоловіком в посилання. У 1739 р. И.А. Долгорукий був страчений. Мужньо перенісши всі страждання, княгиня описала їх в “Своєручних записках” (видані в 1810г.) і стала таким чином першим російським мемуаристом, чиє життя було прикладом великого упокорювання. Своя обручка Н.
Долгорукова, за переказами, кинула перед постриженням до Дніпра.
Ок. 1760г. у монастирі прийняла іночество і в баченні отримала вказівку Божієй Матері заснувати в Росії четверту долю Пречистою на землі – Серафімо-дівєєвськую обітель- подвижник Олександра Мельгунова. Свій чернечий шлях почала у Флоровськом монастирі і блаженна Ірина Зеленогорськая.